L'obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di inibire l'espressione della proteina Bax in cellule emopoietiche mieloidi HL-60 tramite l'uso di oligonucleotidi "antisenso". Lo scopo di questo studio è stato duplice: da una parte chiarire il ruolo giocato da Bax nel complesso equilibrio proteico che regola l'apoptosi, dall'altra costruire un valido modello per un futura indagine mirante a valutare una serie di modifiche chimiche sulla struttura degli oligonucleotidi al fine di ottimizzare il loro impiego nella strategia antisenso. Il lavoro sperimentale è stato svolto, in pressoché egual misura, a Bologna e a Modena. La parte di sintesi chimica è stata seguita dal Dott. Massimo Capobianco, presso L'Istituto dei Composti del Carbonio contenenti Eteroatomi e loro Applicazioni (ICOCEA) del Consiglio Nazionale delle Ricerche di Bologna. Gli esperimenti biologici sono stati effettuati sotto la supervisione del Prof. Sergio Ferrari e della Dott.ssa Rossella Manfredini presso l'Istituto di Chimica Biologica dell'Università di Modena. La metodologia antisenso è un'acquisizione relativamente recente della biologia molecolare, essendo nata alla fine degli anni settanta. Essa si basa sul fatto che è possibile inattivare l'azione di un gene inibendo la sintesi della sua proteina, mediante l'uso di un oligonucleotide sintetico, con sequenza complementare ad un tratto dell'RNA messaggero. L'oligonucleotide, infatti, ibridizzandosi al messaggero del gene interferisce con il processo di traduzione. La portata di questa metodologia va ben oltre il suo uso come strumento di indagine biologica: gli oligonucleotidi antisenso potrebbero rappresentare una nuova classe di farmaci caratterizzati da un meccanismo d'azione altamente specifico ed in grado di essere progettati a tavolino (rational drug design). Attualmente numerosi gruppi di ricerca ne studiano le possibilità di applicazione come antivirali e antitumorali. In questa tesi si è cercato di approfondire il ruolo svolto dal gene bax, recentemente scoperto. La proteina Bax è un membro della famiglia di Bcl-2, ma a differenza di questa, favorisce il programma di morte cellulare. Bax interviene in una serie di equilibri di omo- ed eterodimerizzazione tra i membri di questa famiglia, di cui sono finora noti: Bcl-2, Bax, Bak, Bad, Bcl-xL, Bcl-xS ed Mcl-1. Sono stati preparati due oligonucleotidi antisenso complementari a due zone contigue sull'RNA messaggero di bax ed altri due oligonucleotidi, con uguale sequenza ma con polarità invertita, utilizzati come controlli. L'effetto degli oligonucleotidi è stato testato su una coltura di cellule mieloidi HL-60 che normalmente va in apoptosi a seguito del differenziamento indotto da acido retinoico (ATRA). Si è visto che le sequenze antisenso sono efficaci nel legarsi all'mRNA di bax e nell'inibire la sintesi della proteina in modo specifico. Come risultato, la linea cellulare in seguito al completamento del differenziamento, non va in apoptosi. Ciò dimostra che la proteina Bax, nella linea cellulare esaminata, non può essere vicariata da altre proteine omologhe nel portare la cellula al suicidio programmato. Tale risultato è in linea con recenti esperimenti, descritti in letteratura, utilizzanti altre tecniche. Parallelamente all'esecuzione degli esperimenti biologici sono stati sintetizzati i reagenti necessari per legare una corta catena alchilica alle estremità di un oligonucleotide. Questo tipo di modifica è stato progettato con lo scopo di incrementare la resistenza degli oligonucleotidi alla degradazione enzimatica, senza alterarne significativamente le proprietà ibridizzanti.
Sintesi di oligonucleotidi antisenso per il controllo dell'espressione genica: inibizione del gene bax ed effetto sull'apoptosi
1996
Abstract
L'obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di inibire l'espressione della proteina Bax in cellule emopoietiche mieloidi HL-60 tramite l'uso di oligonucleotidi "antisenso". Lo scopo di questo studio è stato duplice: da una parte chiarire il ruolo giocato da Bax nel complesso equilibrio proteico che regola l'apoptosi, dall'altra costruire un valido modello per un futura indagine mirante a valutare una serie di modifiche chimiche sulla struttura degli oligonucleotidi al fine di ottimizzare il loro impiego nella strategia antisenso. Il lavoro sperimentale è stato svolto, in pressoché egual misura, a Bologna e a Modena. La parte di sintesi chimica è stata seguita dal Dott. Massimo Capobianco, presso L'Istituto dei Composti del Carbonio contenenti Eteroatomi e loro Applicazioni (ICOCEA) del Consiglio Nazionale delle Ricerche di Bologna. Gli esperimenti biologici sono stati effettuati sotto la supervisione del Prof. Sergio Ferrari e della Dott.ssa Rossella Manfredini presso l'Istituto di Chimica Biologica dell'Università di Modena. La metodologia antisenso è un'acquisizione relativamente recente della biologia molecolare, essendo nata alla fine degli anni settanta. Essa si basa sul fatto che è possibile inattivare l'azione di un gene inibendo la sintesi della sua proteina, mediante l'uso di un oligonucleotide sintetico, con sequenza complementare ad un tratto dell'RNA messaggero. L'oligonucleotide, infatti, ibridizzandosi al messaggero del gene interferisce con il processo di traduzione. La portata di questa metodologia va ben oltre il suo uso come strumento di indagine biologica: gli oligonucleotidi antisenso potrebbero rappresentare una nuova classe di farmaci caratterizzati da un meccanismo d'azione altamente specifico ed in grado di essere progettati a tavolino (rational drug design). Attualmente numerosi gruppi di ricerca ne studiano le possibilità di applicazione come antivirali e antitumorali. In questa tesi si è cercato di approfondire il ruolo svolto dal gene bax, recentemente scoperto. La proteina Bax è un membro della famiglia di Bcl-2, ma a differenza di questa, favorisce il programma di morte cellulare. Bax interviene in una serie di equilibri di omo- ed eterodimerizzazione tra i membri di questa famiglia, di cui sono finora noti: Bcl-2, Bax, Bak, Bad, Bcl-xL, Bcl-xS ed Mcl-1. Sono stati preparati due oligonucleotidi antisenso complementari a due zone contigue sull'RNA messaggero di bax ed altri due oligonucleotidi, con uguale sequenza ma con polarità invertita, utilizzati come controlli. L'effetto degli oligonucleotidi è stato testato su una coltura di cellule mieloidi HL-60 che normalmente va in apoptosi a seguito del differenziamento indotto da acido retinoico (ATRA). Si è visto che le sequenze antisenso sono efficaci nel legarsi all'mRNA di bax e nell'inibire la sintesi della proteina in modo specifico. Come risultato, la linea cellulare in seguito al completamento del differenziamento, non va in apoptosi. Ciò dimostra che la proteina Bax, nella linea cellulare esaminata, non può essere vicariata da altre proteine omologhe nel portare la cellula al suicidio programmato. Tale risultato è in linea con recenti esperimenti, descritti in letteratura, utilizzanti altre tecniche. Parallelamente all'esecuzione degli esperimenti biologici sono stati sintetizzati i reagenti necessari per legare una corta catena alchilica alle estremità di un oligonucleotide. Questo tipo di modifica è stato progettato con lo scopo di incrementare la resistenza degli oligonucleotidi alla degradazione enzimatica, senza alterarne significativamente le proprietà ibridizzanti.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
