Sintesi e caratterizzazione di oligonucleotidi chimerici

In questi ultimi anni si è via via perfezionata una metodologia di controllo, o più precisamente di inibizione, dell'espressione genica mediante utilizzo di oligonucleotidi. Tale metodologia è nota col nome di "metodologia antisenso" in quanto fondata sull'uso di sequenze oligonucleotidiche complementari, secondo i legami di Watson e Crick, alla sequenza dell'RNA codificante (senso) per una specifica proteina. Tale metodologia, se da una parte si propone come fine ultimo lo sviluppo di farmaci a disegno razionale, è dall'altra molto più solidamente e largamente usata in colture cellulari per lo studio dei geni e delle loro proteine. Senza entrare nei dettagli di tale tecnica, oggetto di un prossimo capitolo, è sufficiente dire fin da ora che uno dei principali ostacoli all'impiego estensivo di tale metodologia è costituito dalla facile degradabilità degli oligonucleotidi naturali ad opera delle nucleasi, diffuse ubiquitariamente in tutti i tessuti. Scopo di questo lavoro di tesi è stato di preparare oligonucleotidi parzialmente modificati "chimerici", e di valutare le loro proprietà chimico-fisiche in vista di un potenziale impiego come regolatori dell'espressione genica. In particolare, considerando che le nucleasi più attive sono quelle che degradano gli oligonucleotidi a partire dalle estremità (esonucleasi) abbiamo pensato di modificare gli oligonucleotidi, altrimenti naturali, legando loro corte catene di tipo alchilico o un derivato largamente modificato dell'uridina (un costituente dell'RNA). La resistenza alla degradazione degli oligonucleotidi così preparati è stata confrontata con quella dell'oligonucleotide naturale e con quella dell'analogo oligonucleotide fosforotioato (una delle modifiche più utilizzate in questo campo). Oligonucleotidi chimerici contenenti soltanto 4 o 7 legami di tipo fosfodiesterico (fosforotioati) su 19 sono stati anche valutati sempre col presupposto che le esonucleasi siano le fosfodiesterasi più attive. Questo lavoro, svolto presso un laboratorio dell'ICOCEA-CNR di Bologna, ha richiesto oltre alle normali competenze pregresse, una larga parte di sintesi organica mirate alla preparazione degli intermedi necessari, la derivatizzazione dei supporti solidi necessari alla preparazione degli oligonucleotidi, la modifica, in alcuni casi, dei protocolli di sintesi supportata, una completa purificazione e caratterizzazione dei composti ottenuti, via cromatografia su silice e HPLC (analitico e preparativo), analisi di spettroscopia magnetica nucleare al protone, carbonio e fosforo, e determinazioni spettrofotometriche nell'ultravioletto. Oltre a ciò, questo lavoro ha richiesto la messa a punto delle tecniche enzimatiche mai usate prima nel laboratorio da me frequentato.