Impiego delle tecniche di ingegneria tissutale nello sviluppo di protesi vascolari cellularizzate

- Sono state acquisite di nuove conoscenze per lo sviluppo di metodiche per l'isolamento, mantenimento in coltura e differenziazione di cellule progenitrici endoteliali (EPCs) da sangue periferico di minipig. Si è dimostrato che il sangue di minipig può offrire una valida sorgente per ottenere, con buona resa, cellule staminali con capacità differenziativa in senso endoteliale. Questa metodica ha consentito di ottenere in 2-3 settimane un numero sufficiente di cellule autologhe per la semina sullo scaffold prima dell'impianto. - Sono state acquisite nuove conoscenze per la procedura di "coating" della superficie luminale microporosa dello scaffold tubolare a base di "semi-interpenetrating polymeric network" (semi-IPN) PEtU-PDMS, con un sottile ed omogeneo strato di fibrina umana. - Sono state acquisite nuove conoscenze per la semina e mantenimento in coltura nel bioreattore delle EPCs di minipig su scaffold tubolare in semi-IPN precedentemente trattato con fibrina. Sono state individuate le condizioni ottimali di rotazione dello scaffold che garantiscono una distribuzione omogenea delle EPCs sulla superficie luminale. - E' stata ottimizzata la coltura in vitro di costrutti vascolari ingegnerizzati a base di HYAFF. Mediante tecniche di coltura basate su bioreattori a perfusione e a rotazione appositamente progettati, si è ottenuta la riduzione dell'apoptosi cellulare ed il miglioramento delle proprietà meccaniche dei costrutti ingegnerizzati. Inoltre, è emerso che la produzione di matrice extracellulare e le proprietà meccaniche dei costrutti coltivati nel bioreattore a rotazione sono superiori rispetto a quelli coltivati nel bioreattore a perfusione, a loro volta superiori rispetto allo statico. - Sono state acquisite nuove conoscenze per l'endotelializzazione in vitro di protesi di piccolo calibro a base dell'estere benzilico dell'acido ialuronico con EPCs isolate da sangue periferico e da tessuto adiposo umano. - Sono emerse nuove idee per la rigenerazione guidata in vivo di arterie di piccolo calibro mediante utilizzo di protesi a base dell'estere benzilico di acido ialuronico non cellularizzate. - E' proseguita la realizzazione degli scaffolds tubolari in semi-IPN mediante tecnologia spray, associata ad inversione di fase del materiale. I dispositivi realizzati possiedono caratteristiche strutturali e meccaniche idonee per l'impianto nel modello animale di minipig. - E' stato realizzato e messo a punto un bioreattore per mantenere in rotazione controllata costrutti cellulari adeguatamente ossigenati. - E' stata sviluppata la metodica di isolamento e differenziazione di EPCs da sangue periferico di minipig; le cellule mononucleate, ottenute mediante centrifugazione su gradiente di densità, sono state mantenute in coltura in un terreno addizionato con fattori di crescita in grado di promuovere la differenziazione in senso endoteliale e la loro espansione in vitro. - Sono state sviluppate metodiche di immunocitochimica e citofluorimetria a flusso per la valutazione dell'espressione di proteine specifiche del fenotipo endoteliale (vWF, VE caderina, CD31) nelle EPCs. - E' stata messa in opera la procedura di semina e mantenimento in coltura delle EPCs nello scaffold tubolare semi-IPN fino ad ottenere un monostrato sub-confluente di cellule prima dell'impianto dello scaffold bio-artificiale. - E' stata messa a punto la procedura chirurgica per l'impianto nel modello animale di minipig dello scaffold semi-IPN tal quale (controllo) ed endotelializzato con cellule autologhe (campione) a livello dell'arteria carotide di minipig. È eseguita una doppia anastomosi termino-terminale con tecnica di sutura a punti staccati. - E' stata sviluppata la metodica di immunoistochimica per la valutazione dell'espressione di molecole specifiche del fenotipo endoteliale (vWF, VE caderina, CD31) e muscolare liscio (actina, calponina) nelle protesi espiantate. - Sono state sviluppate metodiche di coltura dinamica di costrutti ingegnerizzati a base di HYAFF. Tali protocolli consistono nella stimolazione meccanica dei costrutti con un flusso pulsante di medium di coltura nel lume con un bioreattore a perfusione, o, in alternativa, la coltura in bioreattore a rotazione che aumenta l'ossigenazione del terreno di coltura. - E' stato effettuato l'isolamento di EPCs da sangue periferico umano mediante utilizzo di cell-sorter. - Sono state impiantate su maiali protesi a base dell'estere benzilico dell'acido ialuronico; il monitoraggio della pervietà è stato effettuato mediante eco-color doppler ed analisi istologiche dei campioni espiantati. - Sono stati sviluppati prototipi di bioreattore a rotazione per aumentare gli scambi gassosi all'interno del terreno di coltura. - E' proseguita con continuità la sintesi del materiale elastomerico semi-IPN necessario per la realizzazione degli scaffolds tubolari utilizzati per la sperimentazione animale.