Overespressione e secrezione di nuove varianti di pro-Nerve Growth Factor ricombinante umano in cellule HeLa

L'NGF maturo (mNGF) è un importante fattore neurotrofico prodotto a partire da due varianti di splicing che generano due diversi precursori: il proNGF-A ed il proNGF-B. In cellule PC12 stimolate con proNGF-A e proNGF-B purificati dalle ghiandole sottomandibolari di topo, si osserva un effetto rispettivamente neurotrofico e pro-apoptotico. Inoltre, la disregolazione del rapporto fisiologico tra le due varianti è stata osservata in un modello di encefalopatia diabetica. Queste evidenze suggeriscono un diverso ruolo biologico attribuibile alle due varianti di proNGF. Il processo di conversione proteolitica del proNGF-A in proNGF-B e/o in mNGF, che sembra essere irrilevante in vivo, è invece presente nei diversi sistemi di espressione eterologa utilizzati per produrre il proNGF e rende difficile studiare le possibili differenze nell'attività biologica dei due precursori. Nonostante in letteratura siano già stati descritti proNGF ricombinanti, nessun lavoro si è concentrato nel confronto dei differenti profili biologici delle due proteine. Inoltre, il proNGF-B è attualmente l'unica variante prodotta tramite un sistema batterico, in cui la proteina non subisce le modifiche post-traduzionali che normalmente avvengono in un sistema eucariotico, rendendo di difficile confrontabilità il comportamento biologico di tale proteina rispetto a quella nativa. In questa tesi, si è cercato di caratterizzare le varianti di proNGF umano ricombinante resistenti al taglio proteolitico da parte di proconvertasi, allo scopo di mettere a punto un futuro sistema di espressione eucariotico e di purificazione di proNGF-A. Cellule HeLa sono state trasfettate con plasmidi (proNgf-A wt, proNgf-A KG-RG, proNgf-A A73Y/KG-RG), contenenti diverse sequenze native di proNGF-A, precedentemente sottoposte a mutagenesi nei siti di taglio potenziale da parte di endoconvertasi. Successivamente, sono state condotte analisi allo scopo di verificare che le mutazioni introdotte fossero funzionali e per studiare il tipo di conversione proteolitica e secrezione delle proteine d'interesse, sia in condizioni di rilascio costitutivo che stimolo-dipendente. Nel proNGF-A KG-RG, resistente alla conversione in mNGF, permane la trasformazione del proNGF-A in proNGF-B, confermando l'esistenza ed attività di tale modalità di processamento intracellulare. Inoltre, il proNGF-B prodotto si localizza in vescicole secretorie a rilascio costitutivo. Il plasmide proNgf-A A73Y/KG-RG è l'unico in grado di generare la produzione di un proNGF-A integro da parte delle cellule trasfettate. È stato osservato che il proNGF-A, il quale probabilmente si localizza in vescicole elletrondense di grandi dimensioni nel citoplasma cellulare, viene rilasciato solo in seguito alla stimolazione con sodio butirrato, per essere processato nello spazio extracellulare in diversi intermedi proteolitici. Dopo stimolazione con sodio butirrato e salbutamolo delle cellule trasfettate con proNgf-A KG-RG, si verifica la conversione extracellulare in mNGF, suggerendo la presenza di ulteriori siti di consenso per enzimi diversi rispetto alle pro-convertasi. Nel proNGF-A rilasciato in tali condizioni, invece, risulta assente questo tipo di conversione proteolitica.Dunque, i nostri dati dimostrano che le mutazioni inserite permettono di ottenere un proNGF-A integro ed utilizzabile per ulteriori studi di funzionalità in vitro e in vivo. Inoltre, il nostro lavoro identifica la presenza di distinti pattern di secrezione del proNGF; rispettivamente stimolo-dipendente per il proNGF-A e costitutivo per il proNGF-B. Questo avvalora ulteriormente l'ipotesi di due distinti ruoli biologici attribuibili ai due precursori di NGF e permette una maggiore comprensione delle caratteristiche fisiologiche delle due varianti.