Pseudoalteromonas haloplanktis è un eubatterio psicrofilo isolato da sedimenti marini antartici e pertanto potenzialmente più esposto allo stress ossidativo rispetto ad un organismo mesofilo a causa dell'aumentata solubilità dell'ossigeno a freddo. E' noto che in organismi anche filogeneticamente distanti il glutatione (GSH) svolge un efficace sistema di controllo dello stato redox cellulare. In questo laboratorio è stato recentemente dimostrato che questo tiolo agisce anche su alcuni enzimi antiossidanti purificati da P. haloplanktis. Pertanto si è deciso di studiare il sistema preposto alla sintesi del glutatione per la prima volta in un organismo psicrofilo. Nel genoma di P. haloplanktis sono stati identificati i geni codificanti per la sintesi di GSH; infatti questo tripeptide costituito da cisteina, glicina e acido glutammico è sintetizzato ad opera degli enzimi glutammil-cistein-ligasi (PhGshA) e glutatione sintetasi (PhGshB). Per studiare questi componenti proteici, sono state ottenute loro forme ricombinanti grazie all'amplificazione e clonaggio dei rispettivi geni in un idoneo vettore di espressione. È stato già ottenuto il primo enzima (rPhGshB) di cui è stata dosata l'attività con un metodo radioattivo diretto, basato sull'idrolisi del substrato radioattivo [?-32P]ATP. Dopo aver stabilito che il pH ottimale era compreso tra 7.5 e 7.8, è stata valutata la termofilicità e l'affinità di rPhGshB per il substrato ATP mediante la determinazione dei parametri cinetici kcat e Km nell'intervallo di temperatura 10-30°C. Dai risultati ottenuti è emerso che rPhGshB possiede una significativa attività anche a basse temperature; inoltre, in tutto l'intervallo di temperatura, Km oscilla solo tra 0.14 e 0.25 mM, rendendo così possibile l'analisi dei valori di kcat secondo il plot di Arrhenius. Nell'intervallo di linearità del plot (10-25°C) è stata calcolata un'energia di attivazione di 78.6 kJ/mol, valore insolitamente elevato per un enzima psicrofilo. La termostabilità di rPhGshB è stata analizzata incubando l'enzima per 10 min a temperature fino a 70°C. Dal profilo di inattivazione è stata estrapolata una semivita di 10 min a 50.5°C, valore leggermente elevato per un enzima psicrofilo, anche se non insolito per enzimi antiossidanti. Sono stati infine determinati i parametri energetici del processo di inattivazione termica mediante lo studio delle relative cinetiche a temperature comprese tra 45 e 54°C. Il valore di 208 kJ/mol calcolato per l'energia di attivazione rientra tra quelli ottenuti per altri enzimi psicrofili.
Il sistema preposto alla sintesi del glutatione nell'eubatterio psicrofilo Pseudoalteromonas haloplanktis.
R Rullo;
2010
Abstract
Pseudoalteromonas haloplanktis è un eubatterio psicrofilo isolato da sedimenti marini antartici e pertanto potenzialmente più esposto allo stress ossidativo rispetto ad un organismo mesofilo a causa dell'aumentata solubilità dell'ossigeno a freddo. E' noto che in organismi anche filogeneticamente distanti il glutatione (GSH) svolge un efficace sistema di controllo dello stato redox cellulare. In questo laboratorio è stato recentemente dimostrato che questo tiolo agisce anche su alcuni enzimi antiossidanti purificati da P. haloplanktis. Pertanto si è deciso di studiare il sistema preposto alla sintesi del glutatione per la prima volta in un organismo psicrofilo. Nel genoma di P. haloplanktis sono stati identificati i geni codificanti per la sintesi di GSH; infatti questo tripeptide costituito da cisteina, glicina e acido glutammico è sintetizzato ad opera degli enzimi glutammil-cistein-ligasi (PhGshA) e glutatione sintetasi (PhGshB). Per studiare questi componenti proteici, sono state ottenute loro forme ricombinanti grazie all'amplificazione e clonaggio dei rispettivi geni in un idoneo vettore di espressione. È stato già ottenuto il primo enzima (rPhGshB) di cui è stata dosata l'attività con un metodo radioattivo diretto, basato sull'idrolisi del substrato radioattivo [?-32P]ATP. Dopo aver stabilito che il pH ottimale era compreso tra 7.5 e 7.8, è stata valutata la termofilicità e l'affinità di rPhGshB per il substrato ATP mediante la determinazione dei parametri cinetici kcat e Km nell'intervallo di temperatura 10-30°C. Dai risultati ottenuti è emerso che rPhGshB possiede una significativa attività anche a basse temperature; inoltre, in tutto l'intervallo di temperatura, Km oscilla solo tra 0.14 e 0.25 mM, rendendo così possibile l'analisi dei valori di kcat secondo il plot di Arrhenius. Nell'intervallo di linearità del plot (10-25°C) è stata calcolata un'energia di attivazione di 78.6 kJ/mol, valore insolitamente elevato per un enzima psicrofilo. La termostabilità di rPhGshB è stata analizzata incubando l'enzima per 10 min a temperature fino a 70°C. Dal profilo di inattivazione è stata estrapolata una semivita di 10 min a 50.5°C, valore leggermente elevato per un enzima psicrofilo, anche se non insolito per enzimi antiossidanti. Sono stati infine determinati i parametri energetici del processo di inattivazione termica mediante lo studio delle relative cinetiche a temperature comprese tra 45 e 54°C. Il valore di 208 kJ/mol calcolato per l'energia di attivazione rientra tra quelli ottenuti per altri enzimi psicrofili.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
