PROPRIETA' DI AUTOFLUORESCENZA DI CELLULE STAMINALI MURINE IN FASI PRECOCI DI DIFFERENZIAMENTO

Le ricerche pionieristiche di Britton Chance sull'autofluorescenza (AF) cellulare dimostrarono la correlazione tra stato redox del NAD(P)H e transizioni anaerobiche di metabolismo energetico, avviando numerosissime ricerche sui fluorofori endogeni quali biomarcatori intrinseci di substrati biologici. Recentemente gli studi di AF sono stati applicati anche alle cellule staminali e al differenziamento, suggerendo la possibilità di discriminare cellule in "propagation" da quelle completamente differenziate (es. adipociti, osteociti). In questo contesto il nostro interesse è volto all'AF in correlazione agli aspetti metabolico-funzionali cellulari, sia per il monitoraggio del corso di differenziamento, che per la verifica di engrafting nei tessuti, senza somministrazione di marcatori esogeni. L'attuale fase di lavoro ha riguardato campioni di: cellule staminali embrionali murine indifferenziate (HM1-SSEA 1+, marcatore di pluripotenza), nei primi stadi di differenziamento spontaneo (HM1-SSEA 1-), e corpi embrioidi in differenziamento spontaneo (EBs HM1). Le cellule sono state analizzate in condizioni vitali con tecniche di imaging, microspettrofluorimetria e fitting spettrale, quest'ultimo basato sulle funzioni che descrivono il profilo di emissione di ogni fluoroforo e che fornisce informazioni quantitative in modo simile ad un'analisi biochimica in situ. L'analisi spettrale di AF delle cellule sia organizzate in colonie (indifferenziate), che più isolate (in differenziamento) ha dimostrato che: 1) le lipofuscine diminuiscono nel corso del differenziamento, in accordo con la riduzione dell'autofagia ed il suo ruolo nell'omeostasi della condizione staminale; 2) il NAD(P)H prevale nella forma libera, con variazioni tra tipi cellulari entro piuttosto che tra i diversi campioni, in accordo con le "firme" metaboliche della condizione staminale (alta attività glicolitica) o della potenzialità di differenziamento (funzioni mitocondriali); 3) le porfirine, pur in quantità bassa, mostrano valori maggiori nelle colonie dei campioni meno differenziati, ma un incremento significativo nelle cellule periferiche dei corpi embrioidi, correlabili con la sintesi di eme-proteine. In proposito, è da considerare l'esempio riportato in letteratura sull'attività del complesso III, essenziale nella biogenesi dei mitocondri nel differenziamento a cardiomiociti. In conclusione, i nostri risultati hanno dimostrato la potenzialità dell'analisi di AF nell'evidenziare in tempo reale variazioni biochimiche già in fasi precoci di differenziamento spontaneo, fornendo basi promettenti per il proseguimento degli studi secondo i fini proposti. Finanziato da Regione Lombardia tramite il "Fondo per la promozione di accordi istituzionali".