Mutazioni del gene oncosoppressore p53 sono frequentemente riscontrate nei carcinomi tiroidei indifferenziati ma pressochè assenti nelle neoplasie tiroidee differenziate di tipo papillifero e follicolare. E' stato quindi ipotizzato che, nel processo tumorigenico tiroideo, l'occorrenza di alterazioni di p53 possa determinare l'estrema sdifferenziazione e la notevole aggressività, sia biologica che clinica, proprie del carcinoma tiroideo anaplastico. Abbiamo pertanto valutato l'effetto conseguente alla reintroduzione di una p53 normalmente funzionante in diverse linee cellulari (WRO, ARO, FRO), derivate da carcinomi tiroidei a diverso grado di differenziamento e di malignità. A tale fine è stato utilizzato un vettore plasmidico esprimente una proteina chimerica inducibile alla temperatura di 37° C (p53ER), ottenuta dalla fusione della p53 umana con il dominio di legame ormonale del recettore estrogenico e specificamente attivata dall'analogo ormonale 4-idrossitamoxifene (4-OHT). p53ER è stato transfettato all'interno delle diverse linee cellulari e, dopo opportuna selezione, sono state ottenute popolazioni cellulari che esprimevano stabilmente la p53 esogena normalmente funzionante. La presenza della proteina chimerica nelle diverse cellule tumorali tiroidee è stata valutata sia mediante Western blot che mediante immunofluorescenza indiretta, allo scopo di verificarne la corretta localizzazione intranucleare. L'attività trascrizionale della p53ER è stata determinata mediante esperimenti di transfezione transiente utilizzando un plasmide contenente sequenze di legame per p53 situate a monte del gene reporter CAT. L'espressione di p53ER nelle cellule WRO, derivate da un carcinoma follicolare e contenenti una mutazione della p53 endogena (L223P), provocava una rapida e massiva morte cellulare seguita da un arresto proliferativo pressochè completo delle cellule sopravvissute. La proliferazione delle cellule ARO, derivate da un carcinoma anaplastico e contenenti un gene p53 emizigote e mutato nell'allele residuo (R273H), era fortemente inibita dalla p53ER con accumulo di cellule nella fase G1 del ciclo cellulare. Al contrario, la crescita delle cellule FRO, derivate da un carcinoma scarsamente differenziato ma contenenti una p53 normale, non era influenzata dalla p53ER, un risultato che conferma come un'eccesso di p53 esogena non sia nocivo in cellule già esprimenti una normale funzione di p53. Tale osservazione è particolarmente importante in previsione di esperimenti di terapia genica basati sulla riespressione di p53. In conclusione, il ripristino dell'attività di p53 influenza in maniera diversa l'attività proliferativa di cellule derivate da differenti neoplasie tiroidee umane, in stretta dipendenza con lo stato ed la funzione della p53 endogena (Ricerca finanziata da AIRC, MURST e CNR).
RIPRISTINO DELLA FUNZIONE DI P53 IN CELLULE DERIVATE DA DIFFERENTI ISTOTIPI NEOPLASTICI TIROIDEI UMANI.
1998
Abstract
Mutazioni del gene oncosoppressore p53 sono frequentemente riscontrate nei carcinomi tiroidei indifferenziati ma pressochè assenti nelle neoplasie tiroidee differenziate di tipo papillifero e follicolare. E' stato quindi ipotizzato che, nel processo tumorigenico tiroideo, l'occorrenza di alterazioni di p53 possa determinare l'estrema sdifferenziazione e la notevole aggressività, sia biologica che clinica, proprie del carcinoma tiroideo anaplastico. Abbiamo pertanto valutato l'effetto conseguente alla reintroduzione di una p53 normalmente funzionante in diverse linee cellulari (WRO, ARO, FRO), derivate da carcinomi tiroidei a diverso grado di differenziamento e di malignità. A tale fine è stato utilizzato un vettore plasmidico esprimente una proteina chimerica inducibile alla temperatura di 37° C (p53ER), ottenuta dalla fusione della p53 umana con il dominio di legame ormonale del recettore estrogenico e specificamente attivata dall'analogo ormonale 4-idrossitamoxifene (4-OHT). p53ER è stato transfettato all'interno delle diverse linee cellulari e, dopo opportuna selezione, sono state ottenute popolazioni cellulari che esprimevano stabilmente la p53 esogena normalmente funzionante. La presenza della proteina chimerica nelle diverse cellule tumorali tiroidee è stata valutata sia mediante Western blot che mediante immunofluorescenza indiretta, allo scopo di verificarne la corretta localizzazione intranucleare. L'attività trascrizionale della p53ER è stata determinata mediante esperimenti di transfezione transiente utilizzando un plasmide contenente sequenze di legame per p53 situate a monte del gene reporter CAT. L'espressione di p53ER nelle cellule WRO, derivate da un carcinoma follicolare e contenenti una mutazione della p53 endogena (L223P), provocava una rapida e massiva morte cellulare seguita da un arresto proliferativo pressochè completo delle cellule sopravvissute. La proliferazione delle cellule ARO, derivate da un carcinoma anaplastico e contenenti un gene p53 emizigote e mutato nell'allele residuo (R273H), era fortemente inibita dalla p53ER con accumulo di cellule nella fase G1 del ciclo cellulare. Al contrario, la crescita delle cellule FRO, derivate da un carcinoma scarsamente differenziato ma contenenti una p53 normale, non era influenzata dalla p53ER, un risultato che conferma come un'eccesso di p53 esogena non sia nocivo in cellule già esprimenti una normale funzione di p53. Tale osservazione è particolarmente importante in previsione di esperimenti di terapia genica basati sulla riespressione di p53. In conclusione, il ripristino dell'attività di p53 influenza in maniera diversa l'attività proliferativa di cellule derivate da differenti neoplasie tiroidee umane, in stretta dipendenza con lo stato ed la funzione della p53 endogena (Ricerca finanziata da AIRC, MURST e CNR).I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
