Caratterizzazione dei complessi del Cu(II) con il frammento peptidico corrispondente ai residui 60-114 del prione umano.

Prion diseases are a group of neurodegenerative disease based upon the conformational conversion of the normal form of protein (PrPC) to the disease-related scrapie isoform (PrPSc). The physiological function of PrP has not been identified unambiguously yet, but increasing evidence indicates that it is a copper-binding protein. A series of publications support now that mammalian prion protein contains at least six copper(II) binding sites located at the repeating motif of eight aminoacids between residues 58 and 91, with each repeat containing a histidine residue (tetraoctarepeats domain), and the region between the octarepeat and the C-terminal structured domain containing His96 and His111. Several studies have separately been focused on the octarepeat domain or on the aminoacid region between residues 90 and 126 disregarding the possibility to study the copper(II) complexes with peptide fragments containing both domains. As a matter of fact, we recently reported the speciation and structures of the copper(II) complexes with peptides fragments that allowed us to determine the metal binding affinities of histidyl residues inside and outside the octarepeat domain.3 Our systematic studies of the copper(II) interaction with peptide fragments of prion protein represented a necessary step on the way to a detailed thermodynamic and structural characterization of the metal complexes formed within the entire N-terminal domain. In the present work we synthesized the peptide fragment encompassing the residues 60-114 of prion protein with the aim to unambiguously define the complexation properties the N-terminal domain.To overcome the low solubility constrain, a PEG-ylated derivative of the 60-114 peptide sequence, Ac-(PEG11)3PrP60-114, was synthesized. We investigated the complexation properties of the peptide by UV-vis, circular dichroism (CD), and electrospray ionization mass spectrometry methods and compared these spectra with those of the copper(II) complexes of our previous peptide fragments. This comparative study supported the predominance of macrochelates in the physiological pH range and at low copper occupancy. At increased copper(II) ratios, however, amide bonded species form at the expenses of macrochelate species. At basic pH, the amide bonded species predominate at any ratios and are preferably formed with the binding sites of His96 and His111

Le malattie da prioni rappresentano una classe di patologie neurodegenerative caratterizzate dalla conversione del prione umano (PrPC) in una isoforma patologica (PrPSc).1 Le due isoforme sono caratterizzate dalla stessa sequenza amminoacidica, ma differente struttura terziaria. Nonostante la funzione fisiologica del prione non è esattamente nota, diverse evidenze sperimentali suggeriscono che il PrPC sia una metallo-proteina legata al rame.2 Diversi studi hanno identificato sei siti di legame lungo il segmento flessibile presente nella parte N-terminale del PrP, in corrispondenza dei residui istidinici presenti all'interno delle quattro sequenze ripetitive ottameriche (PHGGGWGQ) e al di fuori di questo dominio (His96 e l'His111). La maggior parte degli studi finalizzati alla caratterizzazione dell'intorno di coordinazione del metallo in corrispondenza di questi siti di legame, è stata eseguita su frammenti peptidici corrispondenti al dominio degli octarepeat o al dominio esterno trascurando lo studio di frammenti peptidici contenenti entrambi i domini. A tal proposito, sono stati recentemente sintetizzati dei frammenti peptidici che hanno permesso di studiare la speciazione, l'affinità e i dettagli di legame dei complessi del Cu(II) con i siti di legame presenti all'interno ed all'esterno del dominio degli octarepeat.3 Lo studio sistematico di questi sistemi ha rappresentato un requisito fondamentale al fine di ottenere una completa caratterizzazione termodinamica e strutturale dei complessi del Cu(II) all'interno del dominio N-terminale della proteina prionica. Con l'obbiettivo quindi di stabilire definitivamente le proprietà di coordinazione della regione N-terminale, nel presente lavoro è stato sintetizzato il frammento peptidico corrispondente ai residui 60-114 del prione umano. Il peptide è stato inoltre coniugato con una molecola di polietilenglicole al fine di aumentare la sua solubilità in solventi acquosi. Le proprietà di coordinazione del peptide sono state investigate mediante tecniche UV-Vis, dicroismo circolare (CD) e spettrometria di massa (ESI-MS). I dati sono stati inoltre confrontati con quelli ottenuti dai precedenti frammenti peptidici studiati. Questo studio comparativo ha evidenziato la formazione di specie complesse macrochelate, caratterizzate dalla coordinazione del Cu(II) mediante gli azoti imidazolici dei residui istidinici, a valori di pH fisiologici e concentrazioni di rame substechiometriche. Aumentando il rapporto metallo/legante, prevalgono le specie complesse caratterizzate dalla deprotonazione e partecipazione delle funzioni ammidiche nell'intorno di coordinazione del metallo. Questo intorno di coordinazione prevale, a pH basici, anche a livelli substechiometrici di Cu(II) ed è localizzato in corrispondenza dei siti di legame His96 e His111.