Imaging Multimodale in campo preclinico: esempi di applicazioni della PET-TC nel topo da laboratorio.

SUMMARY Molecular Imaging is a new research field that integrates morphological data with the analysis of metabolical processes at cellular and subcellular level. Multimodality Imaging, such as PET-CT, has emerged as advanced biomedical technology. At the same time, murine models of human diseases have become most popular, due to their biological similarity to man, their reduced maintenance cost and the ability to modify their genotype. Small animal imaging allow for monitoring in vivo, by serial and non-invasive means, morpho-functional characterization of animal models of human diseases, evaluation of novel therapeutic approaches and development and testing of novel molecular probes [1]. The purpose of this paper is to describe the operative PET -CT protocols and the main applications in the laboratory mouse, to study models of human diseases. BREVE RIASSUNTO INTRODUTTIVO L'Imaging Molecolare è un nuovo campo della ricerca che integra informazioni morfologiche con l'analisi di processi metabolici a livello cellulare e subcellulare. L'Imaging Molecolare Multimodale, in particolare la PET-TC, si è progressivamente affermato in campo clinico e sperimentale. Parallelamente, il topo di laboratorio è diventato il modello animale di prima scelta nella ricerca biomedica, grazie alla omologia fisiologica e genetica con l'uomo, le potenzialità di manipolazione genetica, la praticità ed i bassi costi di allevamento. La Diagnostica per Immagini rappresenta un valido strumento per studiare, in vivo ed in modo non invasivo, la fisiologia, la patogenesi e la progressione di malattie e la risposta a trattamenti terapeutici in modelli animali di malattie umane. [1] Gli scanner PET (Positron Emission Tomography) per piccoli roditori da laboratorio presentano elevata risoluzione e sensibilità grazie alla riduzione del diametro del gantry, delle dimensioni dei detettori e della distanza tra questi. [2] La PET è utile in diversi campi di ricerca, quali neuroscienze, oncologia e cardiologia, in studi di farmacocinetica, terapia genica e di nuovi radiotraccianti. La tomografia computerizzata a raggi X (TC) fornisce informazioni anatomiche addizionali ad alta risoluzione. Attualmente il termine "mini-CT" viene utilizzato per scanner con risoluzione spaziale tra 500 e 100 ?m, "micro-CT" per quelli con risoluzione inferiore a 100 ?m [3,4]. OBIETTIVO DELLO STUDIO Obiettivo del presente lavoro é descrivere i protocolli operativi e le principali applicazioni da noi adottati per la PET-TC nel topo di laboratorio. METODOLOGIE E' stato impiegato uno scanner Explore Vista GEHealthcare, dotato di un anello di 36 detettori LYSO e GSO, con campo di vista trasversale di 6.7 cm e assiale di 4.8 cm, sensibilità del 4% e FWHM PET di 1.6 mm al centro del campo di vista e risoluzione TC 200 ?m, per eseguire studi PET-TC in 83 topi (42 con 18 F-FDG, 5 con 18 F-FLT, 25 con 18 F-RGD e 11 con 18 F-A20-36). Lo scanner presenta un software per ricostruzione ed analisi quantitativa delle immagini. Per alcuni studi selezionati è stato utilizzato anche la ?CT Explore Locus GEHealthcare, con risoluzione 45 e 27?m, il cui software MicroView 2.0 è utile per la ricostruzione tridimensionale delle immagini. Per l'analisi quantitativa del dataset PET di studi cardiologici è stato utilizzato il software "Munich Heart", mentre per la valutazione della ripetibilità intra- ed inter-operatore è stato impiegato il software SPSS, calcolando l' "intraclass correlation coefficient" (ICC) ed il "repeatability coefficient" (RC). Il software Osirix 3.3 ha permesso di ricostruire immagini in formato "Multiplanar Reconstructions" (MPR), "3D volume rendering" e "fusion". Gli studi PET richiedono la preparazione preliminare dei topi. Per le PET con 18F-FDG (fluorodeossiglucosio), i topi sono tenuti a digiuno per circa 6 ore, al fine di uniformare la glicemia nel gruppo sperimentale [5]. L'FDG è un analogo del glucosio e ne riflette il metabolismo nelle cellule. Prima di iniettare il radiofarmaco viene indotta la vasodilatazione della vena laterale della coda, riscaldando i topi con una luce infrarossa. Per iniettare il radiofarmaco, i topi sono posizionati in un "mouse restrainer". Per un'attività specifica ottimale, è stato iniettato un volume massimo di 100 µL, con un'attività di 200-230 µCi. Il periodo di biodistribuzione varia dai 30 ai 60 minuti, in base al radiofarmaco. La PET-TC viene eseguita in anestesia generale, mediante iniezione intraperitoneale di ketamina 100mg/kg + xylazina 10 mg/kg. Infine, poiché la biodistribuzione del 18F-FDG è influenzata negativamente dallo stress da contenimento e dall'ipotermia, i topi vengono anestetizzati per pochi minuti con isofluorano 4% e O21L/min prima dell'iniezione di radiofarmaco e di anestetici, mentre la normotermia viene assicurata con lampada infrared. La durata della PET è circa 30 minuti, 7 minuti per la TC. Al termine della PET-TC viene somministrato atipamezolo 1 mg/kg IP. La procedura descritta è stata adottata anche per esami PET con 18 F-FLT (250 µCi ), 18 F-RGD (150 µCi ), 18 F-A20-36 ( 300 µCi ). RISULTATI Mediante PET-TC con 18F-FDG è stata effettuata una valutazione qualitativa e quantitativa della lesione ischemica cardiaca in un modello chirurgico di infarto del miocardio. L'uptake di FDG a livello miocardico è stato espresso in megaBequerel/cc (MBq/cc), percent injected dose/grams (ID%/g) e standardized uptake value units (SUV). Il software "Munich Heart" ha permesso di calcolare l'estensione dell'area infartuata in cm2 (0,35±0,22 area/cm2) ed in % dell'intera superficie della parete miocardica (36,20±13,06 % area map). La misurazione dell'estensione dell'area infartuata ha mostrato un'eccellente riproducibilità intra ed inter- osservatore (p<0,01) [Fig.1]. Fig.1: immagine di fusione 18F-FDG PET-TC e mappa polare per misurare l' estensione dell'area miocardica infartuata. Nel campo della ricerca oncologica, la PET-TC è stata impiegata per studiare un modello xenograft sottocutaneo di linfoma murino a cellule B; in particolare, è stata testata la capacità del peptide 18F-A20-36 di identificare in vivo le cellule neoplastiche e la loro successiva significativa inibizione della crescita [6] [Fig.2]. Fig.2: immagine di fusione 18F-A20-36 PET-TC di un modello xenograft sottocutaneo di linfoma murino a cellule B. Nell'ambito dello studio del processo di neoangiogenesi tumorale, direttamente correlato all'aggressività ed al potenziale metastatico delle neoplasie, la PET-TC è stata impiegata per studiare un modello xenograft sottocutaneo di melanoma e glioblastoma mediante il pentapeptide ciclico 18F- RGD, specifico antagonista delle integrine ?v?3, testandone la capacità di discriminare tra queste e le ?v?5. Infine, l'imaging PET-TC integrato è risultato di grande utilità per testare in vivo approcci terapeutici innovativi in campo oncologico con siRNA. Per valutare la capacità dei siRNA di inibire la crescita delle cellule tumorali, sono stati caratterizzati mediante PET-TC con 18F-FLT e micro-TC due modelli ortotopici murini di medulloblastoma, le cui cellule erano state infettate rispettivamente con un adenovirus vuoto e uno esprimente siRNA 199/B. Il 18F-FLT (fluorotimidina) è un analogo delle basi azotate, che viene captato dalle cellule con intensa attività mitotica. Le immagini PET-TC sono state ricostruite in formato Multiplanar Reconstructions (MPR), 3D volume rendering e fusion ed è stato calcolato l' SUV massimo e medio ed il volume delle lesioni. Entrambe i topi hanno mostrato una neoplasia captante 18F-FLT, in corrispondenza di un'area osteolitica della calotta cranica, ma nel modello di medulloblastoma transfettato con adenovirus esprimente siRNA 199/B le dimensioni e l'uptake di 18F-FLT della neoplasia sono risultate significativamente inferiori, testimoniando l'inibizione della proliferazione delle cellule neoplastiche [7]. Dimensioni (cm3)SUV maxSUV mean MOCK0,04402,431,6 ADV50,02491,040,7 Analogamente, sono stati caratterizzati mediante PET-TC con 18F-FDG e 18F-FLT due modelli murini ortotopici di medulloblastoma, le cui cellule erano state rispettivamente infettate con un adenovirus vuoto e uno esprimente Sh-Prune RNAs. Le immagini PET-TC sono state ricostruite come le precedenti ed sono stati calcolati l' SUV massimo e medio ed il volume delle neoplasie. La PET con 18F-FDG non è stata utile per visualizzare la neoplasia nel topo ADV5_MOCK, per le sue piccole dimensioni e per l'elevata captazione di 18F-FDG a livello della corteccia cerebrale e del cervelletto. Il topo ADV5_MOCK presentava una lesione nell'emisfero cerebellare sinistro nello studio micro-CT ex vivo, con evidente captazione di 18F-FLT (SUVmax=0,624; SUVmean=0,518) e dimensioni sovrapponibili nelle immagini CT e PET (diametri medi 0,34 x 0,36 cm e volume di 16,5 mm3). Nel topo ADV5_Sh_Prune non sono state riscontrate alterazioni anatomiche né captazione di 18F-FLT nell'encefalo [Fig.3]. Fig.3: immagine di fusione 18F-FDG PET e ?CT di un di un modello ortotopico di medulloblastoma CONCLUSIONI L'Imaging Molecolare Multimodale con PET-TC rappresenta un valido strumento nella ricerca preclinica, per studiare in vivo ed in modo non invasivo modelli animali di malattie umane e testare nuove terapie. Il progresso tecnologico ha consentito lo sviluppo di scanner PET-TC dedicati per piccoli roditori di laboratorio, che forniscono immagini ad alta risoluzione e dati quantitativi accurati. L'imaging con MicroPET-TC fornisce dati morfologici e funzionali, permettendo di monitorare nel tempo ed in uno stesso soggetto la progressione di una patologia o l'effetto di una terapia. Questo contribuisce a migliorare l'accuratezza e la significatività dei risultati sperimentali ed a ridurre il numero di animali impiegati nella ricerca, in accordo con il principio etico di "Refinement, replacement, reduction".