Imaging e manipolazione di embrioni di topo in utero guidata dall'ecografia ad alta risoluzione.

SUMMARY Gestational staging and direct manipulation of mouse embryos in utero has been difficult at most embryonic stages prior to the development of ultrasound biomicroscopy. In utero microinjection of mouse embryos is a valuable tool for exploring the developmental consequences of altering gene expression using viral vectors, for injecting cells to study cell lineage or migration and to validate gene therapies. Microinjections may be performed into the exocoelomic cavity, to study the development of the yolk sac; into the amniotic cavity, for influencing early events in embryonic development such as gastrulation, axis formation and neural tube closure, and into umbilical vessels or placenta, to allow injected agents circulate systemically in the embryo. Ultrasound guided injection had been used to successfully target brain structures or ocular structures. This paper describes ultrasound gestational staging and some basic procedures of in utero microinjection in mice. BREVE RIASSUNTO INTRODUTTIVO La Biomicroscopia ad Ultrasuoni (UBM) rappresenta una metodica di Diagnostica per immagini sperimentale che permette di eseguire studi morfologici e ultrastrutturali in maniera non invasiva e ripetibili nel tempo in modelli animali di malattia umana. Uno dei campi in crescente espansione è quello legato all'ecografia applicata alla diagnosi precoce, alla stadiazione della gravidanza (1-4) e alla microiniezione in utero (5). La microiniezione ecoguidata in utero nel periodo embrionale sta diventando una metodologia molto attrattiva per la prevenzione e la cura di malattie genetiche. Inoltre la terapia genica in età fetale offre altri vantaggi, in quanto può indurre nel feto una tolleranza immunitaria contro i transgeni introdotti, grazie al fatto che il sistema immunitario del feto non è maturo. Inoltre in età fetale è possible bypassare la barriera emato-encefalica per influenzare la differenziazione delle cellule neuronali (6) e delle staminali. La microiniezione in utero ecoguidata nel topo di laboratorio trova diverse applicazioni: veicolare a scopo terapeutico marcatori fluorescenti, materiale genico, cellule, farmaci, vettori virali (7); studi di embriogenesi e/o di lineage cellulare nel l'encefalo (6), nel cuore (8-9), nell'occhio del feto (10), nella cavità amniotica e nei vasi del cordone ombelicale. Esistono ad oggi, due metodiche descritte in letteratura per l'ersecuzione della microiniezione in utero nel topo di laboratorio. OBIETTIVI DELLO STUDIO Scopo del presente lavoro, è quello di descrivere, la nostra personale esperienza in merito all'esecuzione dell'UBM per la diagnosi e stadiazione della gravidanza e per l'esecuzione della microiniezione in utero nel topo di laboratorio. METODOLOGIE Abbiamo monitorato con UBM 10 topi gravidi del ceppo C57Bl/6J a 6.5, 11.5 e 14.5 giorni di gestazione (E6.5, E11.5, E14.5). Per gli studi ecografici i topi venivano anestetizzati con miscela di Isoflurano (2.5%) e Ossigeno ( 1L/min). Venivano quindi posizionati in decubito dorsale su lettino termoriscaldato dove si monitorava la frequenza cardiaca e la temperatura corporea. L'esame ecografico veniva eseguito previa tricotomia dell'addome e interposizione di gel termoriscaldato. Con sonda ecografica da 40 MHz si valutava lo sviluppo delle strutture embrionali nelle diverse fasi gestazionali e venivano effettuate misurazioni morfometriche. La microiniezione ecoguidata veniva eseguita in 5 topi gravidi del ceppo C57Bl/6J a E14.5 secondo il metodo descritto da Punzo (10). Gli animali venivano anestetizzati e preparati per l'UBM come precedentemente descritto. Per l'esteriorizzazione dei corni uterini, il campo operatorio veniva disinfettato con etanolo al 70% e iodopovidone (betadine) diluito al 50% in soluzione fisiologica e, cute e sottocute venivano incisi lungo il piano sagittale mediano per circa 2.5 cm. L'incisione veniva accuratamente circoscritta con garza imbevuta di soluzione fisiologica sterile per evitare il successivo contatto dei corni uterini con la cute. La parete addominale veniva dunque incisa lungo la linea alba per circa 2 cm e i corni uterini esteriorizzati con una pinza adson anatomica. Gli embrioni venivano contati e successivamente i corni uterini riposizionati nella cavità addominale, ad eccezione di un corto segmento contenente da 1 a 3 siti di impianto all'estremità ovarica. Il segmento uterino esposto veniva ricoperto da gel ecografico sterile. La microiniezione è stata eseguita con un microiniettore automatico, equipaggiato con ago-capillare di vetro e montato su un micromanipolatore che consente un preciso allineamento dell'ago lungo il piano ecografico desiderato (Fig 1). Mediante sonda da 55 MHz la struttura bersaglio dell'embrione (cavità amniotica) veniva visualizzata nel campo di vista, e venivano iniettati 69 nL di soluzione fisiologica sterile con ago-capillare di vetro (Fig. 2). Al termine della procedura i corni uterini sono stati detersi con soluzione fisiologica sterile per rimuovere il gel ecografico e reidratare la superficie uterina, e riposizionati delicatamente in addome. La parete addominale (peritoneo e parete muscolare) e cute e sottocute sono stati suturati con Vicryl 8-0 con sutura continua incatenata. L'analgesia è stata assicurata mediante applicazione locale di 25uL di lidocaina 1%, al dosaggio di 4mg/kg, mentre la profilassi antibiotica post-chirurgica è stata realizzata con applicazione topica di gentamicina. La terapia topica ed i controlli UBM (Fig.3) sono stati eseguiti nei due giorni consecutivi la manovra chirurgica.