Sviluppo di un biosensore specifico per la rilevazione del rame in soluzione acquosa tramite una Green Fluorescent Protein ricombinante derivata da Anemonia sulcata

Tra le applicazioni analitiche più innovative ed affascinanti relative alle proteine luminescenti c'è certamente la realizzazione di biosensori cellulari costituiti da batteri e lieviti in grado di rispondere ad uno specifico analita. Malgrado esistano numerosi studi inerenti l'uso delle Green Fluorescent Proteins come marcatori molecolari per l'analisi cellulare, tuttavia pochi sono quelli relativi all'uso delle stesse come indicatori ambientali di inquinamento da metalli. Negli ultimi anni infatti, le proteine fluorescenti risultano attirare l'interesse scientifico in virtù delle loro capacità di variare l'emissione di luce in funzione delle condizioni dell'ambiente circostante. Per tale motivo oggi rappresentano le potenziali candidate per lo sviluppo di biosensori ambientali. Nel presente lavoro, si descrive l'isolamento di una GFP nativa, proveniente da Anemonia sulcata, e il clonaggio e la purificazione della sua equivalente ricombinante prodotta in E.coli. Inoltre, viene analizzato il comportamento spettroscopico delle due GFPs in funzione della presenza nel mezzo di Cu2+, Cd2+, Pb2+ e Ni2+. In particolare, i risultati suggeriscono l'elevate selettività di entrambe la proteine al rame rispetto agli altri metalli selezionati e, per la sola proteina ricombinante, la maggiore sensibilità a concentrazioni di metallo più basse (0.1-1?M range). Partendo da tali risultati e combinando le tecniche di biologia molecolare con quelle ottiche, abbiamo inoltre, sviluppato un sensore per la rilevazione del rame in soluzione acquosa. L'effetto del quenching misurato attraverso l'uso di quest'ultimo risultava in una attenuazione del segnale maggiore (0.46 ± 0.02 AU) rispetto a quello ottenuto con gli spettri di fluorescenza (0.65 ± 0.03 AU). Per concludere: a) la buona sensibilità del sensore sviluppato, pari a due ordini di grandezza relativamente alla concentrazione di Cu2+, b) il fatto che sia assemblato con materiale resistente e low-cost e che c) il quenching della GFP ricombinante sia selettivo verso gli ioni rame, fanno di tale strumento un biosensore low-cost, portatile e specifico per la detection di ione rame.