Variabilità del fitoplasma associato al Legno nero in diversi vigneti del Piemonte

Phytoplasmas in the 16SrXII-A taxonomic subgroup (stolbur, "Candidatus Phytoplasma solani") are responsible for several diseases of herbaceous and woody plants, such as grapevine Bois noir (BN). In the Euro-Mediterranean region, stolbur phytoplasmas are transmitted by insect vectors of the family Cixiidae. Hyalesthes obsoletus Signoret, which is the principal vector of BN phytoplasma (BNp) to grapevine. Biological and genomic variability have been reported for "Ca. P. solani" isolates from different areas and host plants, although low variability was revealed following PCR-RFLP analysis of the 16SrRNA gene (Cimerman et al., 2009; Marcone et al., 1999). Non-ribosomal genes (tuf, vmp1, secY) are currently used as genetic markers, with 16SrDNA for a finer discrimination of phytoplasmas within the 16SrXII-A subgroup (Fialova et al., 2009; Pacifico et al., 2009; Quaglino et al., 2009). In the present study, the genetic diversity of BNp isolates from eight vineyards of the Piedmont region (north-western Italy) was investigated through PCR-RFLP analysis of the vmp1 gene. Weed and grapevine samples were collected in spring, summer and autumn of 2007, 2008 and 2009. BNp infections were identified by reverse transcription-direct PCR, followed by real-time nested PCR with stolburspecific primers, using crude sap extracts from symptomatic samples as the templates (Margaria et al., 2009). Stolbur isolates from insects sampled in the same vineyards were also included in the analysis. BNp was detected in about 66% and 50% of weed and grapevine samples, respectively. Vmp1 fragments of different sizes were amplified from the plant and insect BNp isolates. Several Vmp1 RFLP-types were obtained following the digestion of PCR products with RsaI or AluI endonucleases, confirming the presence of BNp variants in north-western Italian vineyards (Pacifico et al., 2009). In each vineyard, the BNp population was represented by a complex of different vmp1 types, indicating the presence of high genetic variability of the pathogen during the three year survey.

I fitoplasmi appartenenti al sottogruppo tassonomico 16SrXII-A (stolbur, "Candidatus Phytoplasma solani") sono associati a gravi malattie di piante erbacee ed arboree, come il Legno nero (LN) della vite. In Europa e nel Bacino del Mediterraneo lo stolbur è trasmesso da insetti vettori appartenenti alla famiglia Cixiidae, e principalmente dalla specie Hyalesthes obsoletus Signoret. Differenze biologiche e genomiche di isolati di "Ca. P. solani" da ospiti diversi e diversa origine geografica, sono state riportate in letteratura, sebbene tale variabilità non emerga attraverso l'analisi PCR-RFLP del gene 16SrRNA (Marcone et al., 1999; Cimerman et al., 2009). Per tale ragione, marcatori genetici non ribosomali (tuf, vmp1, secY) sono attualmente affiancati all'analisi del 16SrDNA negli studi sulla variabilità genetica di fitoplasmi del gruppo 16SrXII-A (Fialova et al., 2009; Pacifico et al., 2009; Quaglino et al., 2009). In questo lavoro, l'analisi PCR-RFLP del gene vmp1 è stata utilizzata per saggiare la variabilità genetica di isolati di LN provenienti da otto vigneti rappresentativi della produzione vitivinicola piemontese. Campioni di vite e di piante spontanee sono stati prelevati in ciascun vigneto in primavera, estate ed autunno, negli anni 2007, 2008 e 2009. I campioni infetti sono stati identificati attraverso Reverse transcription (RT)-PCR diretta, seguita da PCR nested in real time, con primer stolbur-specifici (Margaria et al., 2009). In aggiunta, sono stati inclusi nelle analisi alcuni isolati di stolbur da insetti catturati nei vigneti in studio. Circa il 66% dei campioni di erbacee infestanti e il 50% dei campioni di vite raccolti nel corso del triennio sono risultati positivi al saggio diagnostico. Frammenti di diversa taglia molecolare del gene vmp1 sono stati amplificati da isolati di LN da vite, spontanee ed insetti. Diversi pattern di restrizione sono stati ottenuti in seguito al trattamento degli ampliconi di PCR con le endonucleasi RsaI o AluI, confermando la presenza di differenti varianti geniche del fitoplasma associato a LN nell'Italia nord occidentale (Pacifico et al., 2009). Nel corso del triennio, in tutti i vigneti in studio, l'infezione da stolbur è risultata associata ad un alto livello di variabilità genetica del patogeno, come confermato dal complesso di profili vmp1 amplificati.