Radiolabeled-Visilizumab, a humanized anti-CD3 monoclonal antibody, for in vivo targeting of human CD3+ lymphocytes

Visilizumab is an IgG2 mAb binding to CD3 expressed on circulating human peripheral T cells and  activated T cells in inflamed tissues. Visilizumab and other anti-CD3 mAbs have been proposed  for treatment of various immune-mediated inflammatory diseases. Aims of present study were  (1) to radiolabel visilizumab with technetium-99m and (2) to validate the binding activity of the  radiolabelled visilizumab in athymic nude mice engrafted with CD3+ tumor cells or with human  peripheral blood lymphocytes (hPBL). For labelling we compared a direct labelling method via  2ME reduction of disulphide bonds with a two-step method using a hetero-bifunctional linker  SHNH/S-HYNIC (succinimidyl-6-hydrazinonicotinate hydrochloride). Binding assay was performed  on HuT 78 cell line. In-vivo studies included a tumour targeting experiment in 9 athymic nude  Balb/c  mice  xenografted  subcutaneously  with  increasing  number  of  HuT  78  cells  in  the  leg  (5x106, 10x106 and 20x106). On the contra lateral thigh, animals were implanted with 10x106  CD3 negative tumor cells as control. Two hours after implant mice were injected in a tail vein  with about 30 µCi (about 100 ng) of radiolabelled Visilizumab. High resolution portable gamma  camera (5x5cm field of view; 2mm spatial resolution) images were acquired 6h and 24h after  injection  and  target  to  background  radioactivity  ratios  were  calculated.  The  ability  of  radiolabelled antibody to study the human lymphocyte trafficking in different organs was tested  in SCID mice model followed by 99mTc-visilizumab injection (or control antibody) and dynamic  high  resolution  imaging  up  to  3h.  Then,  organs  were  collected  in  formalin  vials  and  immunohistological examination was performed to count CD3+ cells in tissues to be compared  with  radioactivity  counted  in  organs.  Visilizumab  was  best  labelled  with  HYNIC  with  a  high  labelling  efficiency  (LE>90%)  and  high  specific  activity  (SA=280-320mCi/mg)  with  retained  biochemical integrity and in vitro binding activity. In tumor targeting experiment, we observed an  increase of uptake of radiolabelled mAb to CD3+ cells compared to CD3- cells and the binding  activity was proportional to the number of injected cells, both at 6h and 24h. In SCID mice,  hPBMCs  in  tissues  were  detected  by  99mTc-labelled  visilizumab  and confirmed  by  histology.  Thus, radiolabelled Visilizumab preferably binds to grafted human T cell in SCID mice and could  be a valuable tool to examine biodistribution of visilizumab in subjects or for imaging T cell traffic  and lymphocytic infiltration in tissues and organs.