OR 3 - Strumenti correttivi innovativi per la rimozione di metaboliti microbici indesiderati nel vino - SAL VII

Identificazione dei ceppi batterici Un isolato rappresentativo di ciascuno dei 27 profili rep-PCR è stato identificato tramite sequenziamento di un frammento di circa 1400 pb del gene del 16S rRNA. Il DNA genomico è stato amplificato con i primer P0 e P6 (Di Cello et al., 1997.Appl Environ Microbiol 63:4485-4493) oppure con i primer 27f-YM e 1492r (Frank et al., 2008. Appl Environ Microbiol 74:2461-2470). Il sequenziamento dei prodotti di PCR del 16S rDNA è stato effettuato con un ABI Prism 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems)utilizzando il BigDyeTM Terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems), i primer P0, P6, 27f-YM, 1492r e primer interni disegnati nel corso delle attività di progetto. Le sequenze del gene del 16S rRNA sono state confrontate con le sequenze dei ceppi-tipo depositate in banca dati (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando il programma BLAST N. I ceppi sono stati identificati assegnando la specie di appartenenza in base al punteggio di allineamento (Score) più elevato e alla percentuale d'identità. Le sequenze hanno mostrato il 98-100% d'identità con quelle dei ceppi-tipo disponibili in banca dati permettendo l'identificazione delle seguenti specie batteriche: Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas plecoglossicida, Pseudomonas reinekei, Pseudomonas koreensis, Pseudomonas baetica, Leclercia adecarboxylata, Enterobacter ludwigii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter xiangfangensis Attività 3.2.2.b- Sequenziamento massivo del DNA genomico - (CNR ISPA e CNR IBBE) I due ceppi ITEM 17016 e 396.1 sono stati sottoposti a caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento massivo del DNA. Il DNA genomico estratto da una singola colonia, mediante le tecniche di estrazione messe a punto precedentemente, è stato sottoposto alla preparazione di una libreria per il sequenziamento massivo di tipo shotgunseguendo il protocollo del kit Nextera XT (Illumina), in modo da ottenere una libreria di DNA con dimensioni medie dell'inserto di 400 bp. La libreria di DNA così ottenuta è stata sottoposta ad analisi qualitativa mediante la piattaforma Bioanalyzer (Agilent) ed ad analisi quantitativa mediante spettrofluorimetro NanoDrop 3300, secondo metodo PicoGreen. Il sequenziamento di tipo paired-end del DNA genomico dei ceppi batterici è stato condotto sulla piattaforma Illumina MiSeq, presente presso l'IBBE, producendo 1.725.303 e 1.184.127coppie di read "paired end" di lunghezza pari a 250 bp per i ceppi ITEM 17016 e 396.1, rispettivamente. Attività 3.2.2.c- Analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento - (CNR ISPA e CNR IBBE) Assemblaggio del genoma. Per l'assemblaggio del genoma di entrambi i ceppi, le read sono state sottoposte ad una procedura di quality trimming, utilizzando un programma da noi sviluppato. Questo programma, utilizza i punteggi di qualità del sequenziamento per calcolare alcune statistiche descrittive (media, mediana, n° di errori atteso) e rimuovere dalle read stesse le regioni di più bassa qualità. Le read che, rimosse le regioni di minor qualità, hanno mantenuto una lunghezza maggiore di 120 bp,sono state utilizzate per l'assemblaggio finale. L'assemblaggio è stato eseguito con il programma SPAdes (Nurk, et al., 2013), mentre lo scaffolding con il programma SSPACE (Boetzer, et al., 2011). Per il ceppo ITEM 17016 si sono ottenuti 28contig e 27 scaffold per un totale di 3.92 Mbp, con un N50 di 298 Kbp, e un contenuto in G+C del 42%, mentre per il ceppo 396.1 40contig, 36 scaffold per un totale di 3.86 Mb, con un N50 di 858 Kbpe un contenuto in G+C del 39.72%. Annotazione del genoma. L'annotazione del genoma dei due ceppi è stata eseguita utilizzando la pipeline standard implementata nell'interfaccia web di Xbase (Chaudhuri, et al. 2008), che prevede l'utilizzo di Glimmer per la predizione dei geni codificanti proteine (Delcher, et al. 2007),tRNAScan-SE (Lowe, et al. 1995) per la predizione dei tRNA e RNAmmer (Lagesen, et al. 2007) per gli rRNA ribosomiali. Il genoma di A. gyllenbergii CIP 110306è stato utilizzato come modello di riferimento per ricavare i parametri necessari a Glimmer (frequenze e composizione dei codoni). Analisi preliminari di genomica comparata hanno svelato che il ceppo 396.1 dovrebbe appartenere alla specie A. calcoaceticus, dato che condivide una identità genomica del 96.3% con altri isolati di questa stessa specie i cui genomi sono già stati sequenziati e pubblicamente disponibili. Al contrario l'ITEM 17016 ha mostrato un livello di identità genomica relativamente basso con le altre specie note di Acinetobacter per un massimo del 86% con A. gyllenbergii. Pertanto, dovrebbe essere considerato a tutti gli effetti una nuova specie (Richter & Mora, 2009) Per tale motivo le analisi successive sono proseguite dando precedenza all'ITEM 17016; tali analisi hanno permesso l'annotazione di 3521 geni per proteina, 183 tRNA e dalle 6 alle 7 copie dell'operone ribosomale. 173 tra i geni annotati non sembrano avere ortologhi nei genomi di tutte le altre specie note di Acinetobacter; tra questi 115 mostrano una similarità significativa a sequenze proteiche depositate nel database NCBI delle proteine non ridondanti (nr) (Pruitt, et al. 2007), 76 dei 115 geni dovrebbero essere paraloghi originati da eventi di duplicazione recente dato che mostrano il maggior livello di similarità con geni presenti nei genomi degli altri Acinetobacter; i restanti 39mostrano identità maggiore verso omologhi di Pseudomonas o Pseudoalteromonas e risultano quindi candidati per acquisizione mediante recente trasferimento orizzontale. Il genoma del ceppo ITEM 17016 è stato depositato nel database Genbank sotto l'accessionnumber JSZD00000000 ed è stato oggetto di una pubblicazione su FEMS Microbiology Letters (Fanelli, Chiara et al., 2014, accepted). Attività 3.2.3.a- Espressione biotecnologica del gene/i identificati- (ISPA-CNR) Al fine di procedere all'espressione biotecnologica dei geni coinvolti nella degradazione di OTA e di supporto alla successiva analisi trascritto mica, abbiamo selezionato dai I 27 ceppi identificati mediante rep-PCR nel SAL precedente il ceppo 159.2, da qui in avanti identificato come ITEM 17016, e il ceppo 396.1, che hanno mostrato attività degradativa. Per l'identificazione dei geni coinvolti nella attività degradativa i due isolati sono stati sottoposti ad una preliminare analisi per definire le condizioni sperimentali ottimali per massimizzare l'efficianza degradativa (variando temperatura ed inoculo iniziale) e quindi massimizzare l'espressione dei geni responsabili di tale attività, e successivamente ad esperimenti di time course. L'attivazione dei pathway biosintetici infatti verrà valutata tramite confronto tra campione incubato con terreno di crescita in presenza di OTA e campione "controllo" in mezzo di coltura semplice. Per le prove sono state utilizzate le seguenti condizioni di crescita: MMP come substrato liquido, OTA, laddove presente, con concentrazione 1?g/ml, tempo di crescita totale di 144 ore a 28° e 120 rpm. Prelievi per le analisi sono stati effettuati a tempo 0, a 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 ore. Per ogni intervallo di tempo considerato sono state valutate le curve di crescita dei due isolati (in presenza ed in assenza di OTA) mediante conta delle colonie formanti unità (CFU) su PCA (Plate count agar) secondo il metodo delle diluizioni seriali. I risultati, mostrati in FIG. 3.2.3.a.1, non evidenziano differenze di vitalità cellulare in assenza o presenza di OTA.