Attività 3.2.2.c - Analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento - (ISPA-CNR, IBBE-CNR) Tutte le read prodotte dal sequenziamento massivo del trascrittoma del ceppo batterico di Acinetobacter ITEM 17016, ai tempi di crescita di 6 e 12 ore, selezionati in base ad analisi di correlazione, (in assenza e in presenza della tossina OTA e in triplicato), sono state analizzate con il software allo stato dell'arte e in accordo al seguente protocollo: -Verifica della qualità delle reads mediante il programma FASTQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) e rimozione delle regioni terminali con basso punteggio di qualità (Q < 25) attraverso il software trim_galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/); -Allineamento delle reads sui contig del genoma di riferimento mediante il software GSNAP (con parametro -N, per nuovi siti di splicing, disattivato) (http://research-pub.gene.com/gmap/); -Conversione degli allineamenti dal formato SAM a quello binario BAM tramite il pacchetto SAMtools (http://www.htslib.org/); -Quantificazione dei trascritti e analisi differenziale dell'espressione genica mediante il pacchetto cufflinks (http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/). L'intera analisi è stata automatizzata con appositi script in linguaggio di programmazione python. Dalla suddetta analisi è stata ottenuta una lista di 111 e 88 geni differenzialmente espressi in presenza di OTA rispettivamente dopo 6 e 12 ore di coltura. Tra questi, mediante analisi condotte su UniProt (www.uniprot.org), sono stati individuati 6 geni codificanti per proteine con attività enzimatiche di peptidasi e idrolasi, che potrebbero essere coinvolti nella degradazione dell'OTA in OTalpha e fenilalanina. Le liste di geni differenzialmente espressi sono state sottoposte ad analisi di arricchimento rispetto ai termini di Gene Ontology utilizzando il tool Bingo, un plugin del software open source Cytoscape (http://www.cytoscape.org). La suddetta analisi ha rivelato l'over-espressione di 34 e 56 pathways rispettivamente nei batteri cresciuti in presenza di OTA per 6 e 12 ore. Tra i pathways che risultano alterati alle 6 ore compaiono i processi di risposta agli stimoli esterni, l'attività peptidasica e il metabolismo degli amminoacidi e delle proteine (Fig. 3.2.2.c1). Tra i pathways disregolati alle 12 ore compaiono le attività relative al catabolismo della fenilalanina e le attività di ossidoriduzione. Questi risultati suggeriscono che inizialmente la presenza di OTA nel mezzo di coltura sia percepita dal batterio come condizione di stress, e che in seguito esso si adatti a questa condizione grazie all'espressione di una serie di geni di risposta allo stress. Inoltre, i risultati dimostrano che la degradazione dell'ocratossina avviene grazie all'attività di una o più peptidasi con il rilascio di fenilalanina che viene subito utilizzata dal batterio grazie all'attivazione degli enzimi coinvolti nel suo catabolismo. Attività 3.2.3.a - Espressione biotecnologica del gene/i identificati - (ISPA-CNR) A seguito dei risultati ottenuti nel precedente periodo di rendicontazione, i 3 geni CPA1, CPA2 e CPA3 di Acinetobacter sp. neg1 sono stati selezionati per la loro elevata similarità con quello codificante una carbossipeptidasi A (CPA) in Bacillus amyloliquefaciens (in grado di degradare l'ocratossina). I tre suddetti geni sono stati inseriti nel vettore plasmidico di espressione pET28a ed i tre plasmidi ricombinanti sono stati utilizzati per rendere competenti le celluledi E. coli Nel presente periodo di rendicontazione, i risultati ottenuti nella Task 3.2.2 hanno evidenziato la presenza nel genoma Acinetobacter sp. neg1 di altre tre differenti sequenze (denominate PJ1852, PJ2037 e PJ2954) codificanti per delle carbossipeptidasi potenzialmente coinvolte nella degradazione dell'OTA. Su di esse sono state costruite tre coppie di primer allo scopo di poterle amplificare mediante PCR. I tre geni amplificati sono stati separatamente purificati da buffer e primers residui e sono stati tagliati con gli enzimi di restrizione NcoI e XhoI. Le reazioni sono state incubate 4 ore a 37°C. Gli inserti, purificati da buffer ed enzimi residui, sono stati clonati all'interno del vettore plasmidico pET28a ed i plasmidi ricombinanti sono stati utilizzati per trasformare cellule di E. coli DH5? rese competenti con cloruro di calcio che, dopo la trasformazione sono state applicate su piastre di LB addizionate con kanamicina (50 ?g/mL). Un clone per ciascuno dei sei geni clonati è stato scelto e l'inserto clonato è stato oggetto di sequenziamento nucleotidico il quale ha confermato per tutti e sei i geni clonati la perfetta concordanza tra le sequenze ottenute e quelle delle stesse porzioni genomiche incluse nella sequenza completa del genoma di Acinetobacter sp. neg1, depositata in banca dati.Il DNA plasmidico con i tre geni (PJ1852, PJ2037 e PJ2954) è stato utilizzato per trasformare cellule competenti di E. coli BL21. Attività 3.2.3.b - Selezione e uso biotecnologico degli enzimi identificati - (ISPA-CNR) Si è quindi provveduto all'espressione in sistema eterologo dei geni ricombinanti e a tale scopo , sono stati condotti esperimenti d'induzione con IPTG dell'espressione dei geni CPA1, CPA2, CPA3, PJ1852, PJ2037 e PJ2954 di Acinetobacter neg1 in E. coli BL21. Nel plasmide utilizzato come vettore di espressione è, infatti, presente un promotore proveniente dal fago T7. Si tratta di un promotore molto efficiente che, tuttavia, per funzionare ha bisogno della RNA polimerasi virale, non essendo riconosciuto dall'analoga polimerasi batterica. Per questo motivo, utilizzando le tecniche dell'ingegneria genetica, nel genoma batterico è stato integrato il gene codificante l'enzima virale. L'espressione di questo gene è però a sua volta controllata e può essere attivata solo dall'aggiunta di IPTG (isopropil-?-D-1-tiogalattopiranoside). Una caratteristica importante del suddetto vettore plasmidico è il fatto che a valle delle sequenze geniche clonate vi è un blocco di 18 nucleotidi codificante per un peptide costituito da 6 istidine. Tenendo conto del loro modulo di lettura, è quindi possibile produrre una CPA contenente, fusa all'estremità C-terminale, la coda di istidine, elemento che facilita enormemente la purificazione della proteina ricombinante. Per ottenere la produzione delle proteine eterologhe in E. coli BL21 sono state testate diverse concentrazioni di IPTG, tempi e condizioni di incubazione Nelle condizioni testate non si è ottenuta la produzione delle proteine desiderata, probabilmente dovuto alla tossicità della proteina per l'organismo ospite e/o a una differenza nel codon usage tra le due specie (i.e.: Acinetobacter sp. neg1 e E. coli). Per cercare di risolvere le difficoltà nella produzione delle proteine di interesse, il DNA plasmidico con i sei geni (CPA1, CPA2, CPA3, PJ1852, PJ2037 e PJ2954) è stato utilizzato per trasformare cellule competenti di due particolari ceppi di E. coli BL21: i) BL21(DE3) pLysE. Questo ceppo fornisce un maggiore controllo della T7 RNA polimerasi, che è necessario quando la proteina ricombinante da esprimere è tossica. ii) BL21-CodonPlus-RIL. Questo ceppo contiene geni che codificano per tRNA che riconoscono i codoni rari AGA e AGG per arginina, il codone AUA per isoleucina, e il codone CUA per leucina. L'induzione delle cellule BL21(DE3) pLysE non a prodotto le proteine attese, mentre con l'induzione delle cellule BL21-CodonPlus-RIL sono state prodotte le proteine Cpa1 e PJ1852. Questo dato evidenzia come la mancata espressione di alcuni, se non di tutti i geni clonati, sia probabilmente dovuta a una differenza nell'uso dei codoni tra Acinetobacter sp. e (E. coli) .Infatti , quando un gene clonato (Acinetobacter sp.) utilizza codoni ai quali la cellula ospite (E. coli) ricorre raramente, si verifica un'incompatibilità cellulare che può interferire con una traduzione efficiente, poiché può accadere che la cellula ospite non produca a sufficienza i tRNA che riconoscono i suddetti codoni di impiego raro e la produzione della proteina risulta conseguentemente inferiore alle aspettative o addirittura assente. L'efficacia degli enzimi di Acinetobacter sp. neg1 prodotti da E. coli nella degradazione dell'ocratossina A è stata testata in saggi in vitro. I ceppi di BL21-CodonPlus-RIL contenenti i geni CPA1 e PJ1852 sono stati indotti con 2 mM di IPTG, 4 ore a 30°C in 10 mL di LB+Kanamicina+Cloramfenicolo. Trascorso il tempo di incubazione, il surnatante è stato recuperato e le cellule sono state risospese in 10 mL di buffer TS (Tris 0.25M, NaCl 1.37M, KCl 0.027M) e lisate utilizzando una French press (3 passaggi a 1700 psi). Il lisato cellulare e il surnatante sono stati aggiunti con 1 ?g/mL di OTA e incubati a temperatura ambiente overnight. Le cellule di BL21-CodonPlus-RIL non trasformate e il mezzo di coltura senza inoculo sono stati usati come controllo. il surnatante delle cellule indotte non ha prodotto degradazione dell'OTA A, probabilmente perché proteina non è secreta nel mezzo. Infatti, l'analisi elettroforetica del precipitato delle proteine totali presenti nel surnatante ha confermato questa ipotesi.
OR 3 - Strumenti correttivi innovativi per la rimozione di metaboliti microbici indesiderati nel vino - SAL VIII
Fanelli F;Liuzzi VC;Grieco F;Pesole G;
2015
Abstract
Attività 3.2.2.c - Analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento - (ISPA-CNR, IBBE-CNR) Tutte le read prodotte dal sequenziamento massivo del trascrittoma del ceppo batterico di Acinetobacter ITEM 17016, ai tempi di crescita di 6 e 12 ore, selezionati in base ad analisi di correlazione, (in assenza e in presenza della tossina OTA e in triplicato), sono state analizzate con il software allo stato dell'arte e in accordo al seguente protocollo: -Verifica della qualità delle reads mediante il programma FASTQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) e rimozione delle regioni terminali con basso punteggio di qualità (Q < 25) attraverso il software trim_galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/); -Allineamento delle reads sui contig del genoma di riferimento mediante il software GSNAP (con parametro -N, per nuovi siti di splicing, disattivato) (http://research-pub.gene.com/gmap/); -Conversione degli allineamenti dal formato SAM a quello binario BAM tramite il pacchetto SAMtools (http://www.htslib.org/); -Quantificazione dei trascritti e analisi differenziale dell'espressione genica mediante il pacchetto cufflinks (http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/). L'intera analisi è stata automatizzata con appositi script in linguaggio di programmazione python. Dalla suddetta analisi è stata ottenuta una lista di 111 e 88 geni differenzialmente espressi in presenza di OTA rispettivamente dopo 6 e 12 ore di coltura. Tra questi, mediante analisi condotte su UniProt (www.uniprot.org), sono stati individuati 6 geni codificanti per proteine con attività enzimatiche di peptidasi e idrolasi, che potrebbero essere coinvolti nella degradazione dell'OTA in OTalpha e fenilalanina. Le liste di geni differenzialmente espressi sono state sottoposte ad analisi di arricchimento rispetto ai termini di Gene Ontology utilizzando il tool Bingo, un plugin del software open source Cytoscape (http://www.cytoscape.org). La suddetta analisi ha rivelato l'over-espressione di 34 e 56 pathways rispettivamente nei batteri cresciuti in presenza di OTA per 6 e 12 ore. Tra i pathways che risultano alterati alle 6 ore compaiono i processi di risposta agli stimoli esterni, l'attività peptidasica e il metabolismo degli amminoacidi e delle proteine (Fig. 3.2.2.c1). Tra i pathways disregolati alle 12 ore compaiono le attività relative al catabolismo della fenilalanina e le attività di ossidoriduzione. Questi risultati suggeriscono che inizialmente la presenza di OTA nel mezzo di coltura sia percepita dal batterio come condizione di stress, e che in seguito esso si adatti a questa condizione grazie all'espressione di una serie di geni di risposta allo stress. Inoltre, i risultati dimostrano che la degradazione dell'ocratossina avviene grazie all'attività di una o più peptidasi con il rilascio di fenilalanina che viene subito utilizzata dal batterio grazie all'attivazione degli enzimi coinvolti nel suo catabolismo. Attività 3.2.3.a - Espressione biotecnologica del gene/i identificati - (ISPA-CNR) A seguito dei risultati ottenuti nel precedente periodo di rendicontazione, i 3 geni CPA1, CPA2 e CPA3 di Acinetobacter sp. neg1 sono stati selezionati per la loro elevata similarità con quello codificante una carbossipeptidasi A (CPA) in Bacillus amyloliquefaciens (in grado di degradare l'ocratossina). I tre suddetti geni sono stati inseriti nel vettore plasmidico di espressione pET28a ed i tre plasmidi ricombinanti sono stati utilizzati per rendere competenti le celluledi E. coli Nel presente periodo di rendicontazione, i risultati ottenuti nella Task 3.2.2 hanno evidenziato la presenza nel genoma Acinetobacter sp. neg1 di altre tre differenti sequenze (denominate PJ1852, PJ2037 e PJ2954) codificanti per delle carbossipeptidasi potenzialmente coinvolte nella degradazione dell'OTA. Su di esse sono state costruite tre coppie di primer allo scopo di poterle amplificare mediante PCR. I tre geni amplificati sono stati separatamente purificati da buffer e primers residui e sono stati tagliati con gli enzimi di restrizione NcoI e XhoI. Le reazioni sono state incubate 4 ore a 37°C. Gli inserti, purificati da buffer ed enzimi residui, sono stati clonati all'interno del vettore plasmidico pET28a ed i plasmidi ricombinanti sono stati utilizzati per trasformare cellule di E. coli DH5? rese competenti con cloruro di calcio che, dopo la trasformazione sono state applicate su piastre di LB addizionate con kanamicina (50 ?g/mL). Un clone per ciascuno dei sei geni clonati è stato scelto e l'inserto clonato è stato oggetto di sequenziamento nucleotidico il quale ha confermato per tutti e sei i geni clonati la perfetta concordanza tra le sequenze ottenute e quelle delle stesse porzioni genomiche incluse nella sequenza completa del genoma di Acinetobacter sp. neg1, depositata in banca dati.Il DNA plasmidico con i tre geni (PJ1852, PJ2037 e PJ2954) è stato utilizzato per trasformare cellule competenti di E. coli BL21. Attività 3.2.3.b - Selezione e uso biotecnologico degli enzimi identificati - (ISPA-CNR) Si è quindi provveduto all'espressione in sistema eterologo dei geni ricombinanti e a tale scopo , sono stati condotti esperimenti d'induzione con IPTG dell'espressione dei geni CPA1, CPA2, CPA3, PJ1852, PJ2037 e PJ2954 di Acinetobacter neg1 in E. coli BL21. Nel plasmide utilizzato come vettore di espressione è, infatti, presente un promotore proveniente dal fago T7. Si tratta di un promotore molto efficiente che, tuttavia, per funzionare ha bisogno della RNA polimerasi virale, non essendo riconosciuto dall'analoga polimerasi batterica. Per questo motivo, utilizzando le tecniche dell'ingegneria genetica, nel genoma batterico è stato integrato il gene codificante l'enzima virale. L'espressione di questo gene è però a sua volta controllata e può essere attivata solo dall'aggiunta di IPTG (isopropil-?-D-1-tiogalattopiranoside). Una caratteristica importante del suddetto vettore plasmidico è il fatto che a valle delle sequenze geniche clonate vi è un blocco di 18 nucleotidi codificante per un peptide costituito da 6 istidine. Tenendo conto del loro modulo di lettura, è quindi possibile produrre una CPA contenente, fusa all'estremità C-terminale, la coda di istidine, elemento che facilita enormemente la purificazione della proteina ricombinante. Per ottenere la produzione delle proteine eterologhe in E. coli BL21 sono state testate diverse concentrazioni di IPTG, tempi e condizioni di incubazione Nelle condizioni testate non si è ottenuta la produzione delle proteine desiderata, probabilmente dovuto alla tossicità della proteina per l'organismo ospite e/o a una differenza nel codon usage tra le due specie (i.e.: Acinetobacter sp. neg1 e E. coli). Per cercare di risolvere le difficoltà nella produzione delle proteine di interesse, il DNA plasmidico con i sei geni (CPA1, CPA2, CPA3, PJ1852, PJ2037 e PJ2954) è stato utilizzato per trasformare cellule competenti di due particolari ceppi di E. coli BL21: i) BL21(DE3) pLysE. Questo ceppo fornisce un maggiore controllo della T7 RNA polimerasi, che è necessario quando la proteina ricombinante da esprimere è tossica. ii) BL21-CodonPlus-RIL. Questo ceppo contiene geni che codificano per tRNA che riconoscono i codoni rari AGA e AGG per arginina, il codone AUA per isoleucina, e il codone CUA per leucina. L'induzione delle cellule BL21(DE3) pLysE non a prodotto le proteine attese, mentre con l'induzione delle cellule BL21-CodonPlus-RIL sono state prodotte le proteine Cpa1 e PJ1852. Questo dato evidenzia come la mancata espressione di alcuni, se non di tutti i geni clonati, sia probabilmente dovuta a una differenza nell'uso dei codoni tra Acinetobacter sp. e (E. coli) .Infatti , quando un gene clonato (Acinetobacter sp.) utilizza codoni ai quali la cellula ospite (E. coli) ricorre raramente, si verifica un'incompatibilità cellulare che può interferire con una traduzione efficiente, poiché può accadere che la cellula ospite non produca a sufficienza i tRNA che riconoscono i suddetti codoni di impiego raro e la produzione della proteina risulta conseguentemente inferiore alle aspettative o addirittura assente. L'efficacia degli enzimi di Acinetobacter sp. neg1 prodotti da E. coli nella degradazione dell'ocratossina A è stata testata in saggi in vitro. I ceppi di BL21-CodonPlus-RIL contenenti i geni CPA1 e PJ1852 sono stati indotti con 2 mM di IPTG, 4 ore a 30°C in 10 mL di LB+Kanamicina+Cloramfenicolo. Trascorso il tempo di incubazione, il surnatante è stato recuperato e le cellule sono state risospese in 10 mL di buffer TS (Tris 0.25M, NaCl 1.37M, KCl 0.027M) e lisate utilizzando una French press (3 passaggi a 1700 psi). Il lisato cellulare e il surnatante sono stati aggiunti con 1 ?g/mL di OTA e incubati a temperatura ambiente overnight. Le cellule di BL21-CodonPlus-RIL non trasformate e il mezzo di coltura senza inoculo sono stati usati come controllo. il surnatante delle cellule indotte non ha prodotto degradazione dell'OTA A, probabilmente perché proteina non è secreta nel mezzo. Infatti, l'analisi elettroforetica del precipitato delle proteine totali presenti nel surnatante ha confermato questa ipotesi.I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
