DART-MS per l’autenticazione dello zafferano: studi preliminari per lo sviluppo di metodi “untargeted” e “targeted” per la rivelazione di adulterazioni da curcuma e cartamo

Lo zafferano rappresenta una delle spezie più preziose e costose al mondo. Coltivato in molte regioni del Mediterraneo, lo zafferano deriva dall’essicazione degli stigmi del fiore della pianta Crocus sativus L. (famiglia Iridaceae) ed è rinomato per le numerose proprietà culinarie e benefiche per la salute umana [1]. A causa degli elevati prezzi e del lavoro richiesto per la sua coltivazione e produzione, tale spezia rappresenta uno dei prodotti alimentari più adulterati al mondo [2]. Frequente è la miscelazione con composti naturali come fiori di altre specie vegetali (Calendula officinalis, Carthamus tinctorius L., etc.) o altre spezie (Curcuma longa etc.), [2]. Attualmente, la qualità dello zafferano è certificata secondo specifiche linee guida ISO [3] per cui è stata dimostrata la difficoltà nel rivelare adulteranti specifici come il cartamo, la calendula o la curcuma ad un livello di adulterazione inferiore al 20% (p/p) [4]. Da tale limitazione deriva la necessità di metodi di screening avanzati e sensibili per assicurare l’autenticità dello zafferano. Nel corso degli ultimi anni la spettrometria di massa (MS) è risultata una delle tecnologie più promettenti per l’autenticazione di questa spezia [1]. In questo contesto, la tecnologia MS basata sulla sorgente “Analisi Diretta in Tempo Reale” (DART-HRMS) è risultata estremamente versatile nella sua applicazione al campo dell’autenticità, data la semplicità nella preparazione del campione e la sua velocità di analisi [5]. La seguente ricerca mira a porre le basi per lo sviluppo di metodi rapidi “untargeted” e “targeted” basati su una sorgente DART interfacciata ad un analizzatore di massa ad alta risoluzione Orbitrap™ per discriminare campioni di zafferano puro e adulterato con cartamo o curcuma. L’indagine è stata condotta su campioni di zafferano puro (n=20) e su campioni di zafferano adulterato con le due spezie a tre diversi livelli di inclusione (5- 10-20%, n=2 per ogni livello) sottoposti ad un processo di estrazione dei metaboliti precedentemente messo a punto presso i nostri laboratori [6]. Gli estratti sono stati successivamente analizzati mediante DART-MS ad alta risoluzione al fine di ottenere dei profili metabolici caratteristici per i campioni di zafferano puro e adulterato con curcuma e cartamo ai diversi livelli. Gli spettri MS ottenuti sono stati quindi processati mediante il software Compound Discoverer v. 3.3 (Thermo Fisher Scientific) per un’analisi statistica preliminare usando un approccio multivariato non supervisionato (PCA). I risultati ottenuti mettendo a confronto il campione puro con quello adulterato al livello minimo (5%) sono rappresentati in figura 1. L’analisi preliminare condotta ha mostrato una buona capacità del test di discriminare fra zafferano puro e adulterato con curcuma e cartamo al livello minimo di adulterazione testato (5%) suggerendo la possibilità, per tale approccio, di discriminare fra campione puro e contraffatto con queste due spezie a valori molto bassi. Fig. 1. Score plot relativi al test statistico PCA realizzato mettendo a confronto i campioni di zafferano puro e adulterato con curcuma e cartamo al livello di adulterazione 5% analizzati tramite DART-MS (modalità di acquisizione +). Parallelamente è stata avviata un’indagine volta all’identificazione di composti peculiari da utilizzare come potenziali marker per la messa a punto di un metodo targeted per l’autenticazione dello zafferano da applicare a sistemi DART-MS a bassa risoluzione e/o piattaforma LC-MS/MS. Sono stati seguiti due approcci via-software: 1) analisi di spettri DART-MS, 2) analisi di spettri LC-MS/MS di campioni di zafferano puro e adulterato con le due spezie. I risultati per il cartamo sono rappresentati in Figura 2. Fig. 2. Tabelle e grafici con le potenziali molecole marker identificate per il cartamo dopo analisi degli spettri DARTMS e LC-MS relativi a campioni di zafferano puro e adulterato. Per le molecole L-Prolina e Quercetina è riportata una curva di calibrazione preliminare basata sulle aree di picco rivelate per la molecola nei tre livelli di adulterazione (5- 10-20%). I risultati ottenuti applicando la tecnologia DART-MS interfacciata a software avanzati di statistica e identificazione di molecole, hanno evidenziato la validità di questa tecnologia nella discriminazione tra zafferano puro e adulterato gettando le basi per la costruzione di modelli basati su un approccio untargeted e targeted da applicare per l’autenticità di questo alimento.